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| 毛细管电泳电导法快速检测复方维生素B片中的VB1 |
| 来源：中国仪器仪表大市场信息中心 时间：2008/7/24 浏览数：2818 【我要关闭】 |
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摘 要：采用高效毛细管电泳电导法同时分离、测定了复方维生素Ｂ片中的主要成分ＶＢ１，ＶＢｌ２，ＶＢ６和ＶＣ的含量。研究了运行缓冲溶液的酸度和浓度、电泳电压、进样时间等因素对电泳的影响。在优化的实验条件下：４０ ｍｍｏｌＬ Ｔｒｉｓ－４ｍｍｏｌＬ Ｈ３ＢＯ３（ｐＨ ８．０）的缓冲溶液中加入０．３０ ｍｍｏｌＬ ＣＴＡＢ（溴化十六烷基三甲基铵），分离电压为１５ｋＶ，上述４组分在５ ｍｉｎ内得到良好的分离。维生素Ｂ１，Ｂ１２，Ｂ６和ＶＣ的线性范围分别为５．５～１．０ｍｇｍＬ；１５～１．５ ｍｇｍＬ；１．０～０．４０ｍｇｍＬ和６．６～０．８０ｍｇｍＬ；检测限分别为０．８０μｇｍＬ，４．０μｇｍＬ，０．５０μｇｍＬ，２．９μｇｍＬ；５次测定峰高的相对标准偏差分别为２．２％，１．６％，３．９％，２．８％。 ５次测定的平均回收率分别为９９％，９４％，１００％，９７％。
关键词：高效毛细管电泳；电导检测；复方维生素Ｂ片
ＶＢ１，ＶＢｌ２，ＶＢ６和ＶＣ都是水溶性的维生素，是维持人体正常代谢功能所必需的生物活性物质。这些药物的分析多是采用分光光度法［１，２］，荧光法［３，４］，高效液相色谱法［５］。分光光度法和荧光法因干扰因素多，谱峰相互重叠而无法同时测定多种维生素，常常需要多种方法相互配合才能完成，不利于快速分析；高效液相色谱也因仪器昂贵，运行成本高，分析时间长而受到限制。高效毛细管电泳（ＨＰＣＥ）在药物和临床研究领域已成为不可缺少的有力手段，已用于几百种药物及各种剂型中主要成分的分析。应用ＨＰＣＥ伏安法分离测定药物中ＶＣ［６］或维生素Ｂ［７］已有报道，但未见有采用电导法同时测定复方维生素Ｂ片中主要成分ＶＢ１，ＶＢｌ２，ＶＢ６和ＶＣ报道。本文采用高效毛细管电泳电导检测法在５ｍｉｎ内快速分离、同时测定复方维生素Ｂ片中主要成分ＶＢｌ，ＶＢｌ２，ＶＢ６和ＶＣ。
１ 实验部分
１．１ 仪器与试剂
毛细管电泳仪为中山大学分析组自组装，包括ＣＺＥ３０ＰＮｌ０ＭＣＮＺ２型高压电源（美国Ｈｉｇｈ Ｖｏｌｔａｇｅ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ Ｃｏｒｐ．），石英毛细管柱５０ｃｍ×７５μｍ（河北永年光导纤维厂），KL－138型电导率仪（科立龙电子有限公司），毛细管电泳数据工作站（ＣＥＳ９８中山大学化学系），毛细管电泳仪装置见文献［８］。KL－013精密酸度计（科立龙电子有限公司）。三羟甲基氨基甲烷（Ｔｒｉｓ，上海试剂三厂，分析纯）；十六烷基三（甲基）溴化铵（ＣＴＡＢ，广州化学试剂厂，分析纯）；硼酸（ＡＲ）；复方维生素Ｂ片（湖南省制药有限公司产品，批号：０００７０２），ＶＢｌ，ＶＢｌ２，ＶＢ６和ＶＣ均为生化试剂，ＶＣ和其它试剂均为分析纯，水为二次去离子水。
１．２ 溶液配制
分别配制１００ ｍｍｏｌＬ ＣＴＡＢ和同浓度的Ｔｒｉｓ、Ｈ３Ｂ０３储备液，各取适量制备不同浓度不同ｐＨ值的缓冲液。ＶＢ１，ＶＢｌ２，ＶＢ６和ＶＣ标准储备液（１．０ｍｇＬ）：每次实验前用二次去离子水新鲜配制。进样用的ＶＢ１，ＶＢｌ２，ＶＢ６和ＶＣ标准溶液用所运行的缓冲液稀释成３０．０μｇｍＬ。
１．３ 实验方法
联接好毛细管电泳仪和检测装置。毛细管在使用前依次用０．１ ｍｏｌＬ ＮａＯＨ，二次重蒸水和缓冲液各冲洗５ ｍｉｎ；Ｐｔ丝检测电极在使用前用超声波清洗，更换缓冲液或每进样４次后需按上述步骤清洗毛细管和电极；采用重力进样方式，进样高度２０ｃｍ，进样时间５ｓ，操作电压１５ｋＶ，电导率仪检测的输出信号经数据工作站采集到微机中进行实时数据处理，图形显示和数据文件存储。实验在恒温（２５℃），恒湿（相对湿度６５％）的实验条件下进行。
２ 结果讨论
２．１ 缓冲溶液的选择
缓冲溶液的选择直接影响离子的迁移和分离。为了使维生素在运行缓冲溶液中离解为离子状态，考察了ＮＨ４ＣＩ－ＮＨ３（ｐＨ９．０）；Ｎａ２ＨＰＯ４－ＮａＨ２ＰＯ４（ｐＨ９．０）；Ｎａ２Ｂ４Ｏ７－Ｈ３ＢＯ３（ｐＨ９．０）；Ｔｒｉｓ－柠檬酸Ｃｉｔ（ｐＨ９．０）；Ｔｒｉｓ－Ｈ３ＢＯ３（ｐＨ ９．０）５种缓冲溶液体系对分离的影响。结果发现在前３种缓冲体系中维生素峰出峰不全，而且体系由于离子强度大，产生较大的焦耳热导致维生素各峰形均有不同程度展宽。在后２种体系中，分离效果好一些，但ＶＣ峰和ＶＢ６峰形有部分重叠。本文选择Ｔｒｉｓ－Ｈ３ＢＯ３为运行缓冲溶液。
２．２ 缓冲液酸度和浓度的影响
考察了Ｔｒｉｓ－Ｈ３ＢＯ３缓冲液中不同的ｐＨ值（ｐＨ７～１０）对分离的影响。实验发现随溶液ｐＨ升高，由于电渗流加快，导致ＶＣ峰和ＶＢ６峰重叠的程度加剧，分离度变差；而在低ｐＨ，ＶＢｌ２和ＶＢ６峰有拖尾。可能是毛细管管壁对样品产生吸附的缘故。其中以ｐＨ ８．０时分离效果较好。为了考察缓冲溶液浓度对分离的影响，配制了１０ ｍｍｏｌＬ Ｔｒｉｓ－１ｍｍｏｌＬ Ｈ３ＢＯ３；２０ ｍｍｏｌＬ Ｔｒｉｓ－２ ｍｍｏｌＬ Ｈ３ＢＯ３；３０ ｍｍｏｌＬ Ｔｒｉｓ－３ ｍｍｏｌＬ Ｈ３ＢＯ３；４０ ｍｍｏｌＬ Ｔｒｉｓ－４ｍｍｏｌＬ Ｈ３ＢＯ３；５０ ｍｍｏｌＬ Ｔｒｉｓ－５ ｍｍｏｌＬ Ｈ３ＢＯ３；６０ｍｍｏｌＬ Ｔｒｉｓ－６ ｍｍｏｌＬ Ｈ３ＢＯ３的缓冲溶液（ｐＨ ８．０）。实验结果发现：随缓冲溶液浓度升高，维生素各峰之间的分离度增大，迁移时间增加，峰的拖尾现象得到改善。我们认为随着溶液浓度增大，离子强度增加，从而改变了缓冲溶液的容量，减少溶质和管壁之间的相互作用。但焦耳热增加，基线不稳，峰形展宽。为了兼顾分离度、峰形和分析速度，选择４０ ｍｍｏｌＬ Ｔｒｉｓ－４ ｍｍｏｌＬ Ｈ３ＢＯ３（ｐＨ ８．０）为运行缓冲液。
２．３ 有机溶剂的影响
为了进一步消除管壁对样品的吸附，从而消除峰的拖尾现象，我们在运行缓冲溶液中加入少量ＣＴＡＢ。发现ＣＴＡＢ对体系的分离影响很大。当加入ＣＴＡＢ的量从０．１～０．５ ｍｍｏｌＬ之间变化，随着ＣＴＡＢ量增加，出峰时间延长，峰形变好，分离度增加，灵敏度提高。但当ＣＴＡＢ量大于或等于０．５０ ｍｍｏｌＬ时，灵敏度下降，出峰时间大大推后。为得到高的灵敏度，缩短分析时间，故选择ＣＴＡＢ的浓度为０．３０ ｍｍｏｌＬ。
２．４ 进样时间的影响
考察进样时间在２～２０ｓ对峰高和分离度的影响。发现随进样时间增加，峰高或峰面积增加。当进样时间达１2ｓ后，峰形展宽且部分重叠，导致分离度下降。因此选择最佳进样时间1０ｓ。
２．５ 分离电压的影响
试验了分离电压６～３０ｋＶ对迁移时间和分离度的影响。在选定的实验条件下，加６ｋＶ分离电，２０ｍｉｎ内无峰出现；随着电压增加，出峰时间迅速提前。当分离电压大于１５ ｋＶ时，焦耳热明显增加，从而使柱效和分离度下降，因此选择分离电压为１５ｋＶ。
电泳条件：４０ ｍｍｏｌＬ Ｔｒｉｓ＋４ ｍｍｏｌＬ Ｈ３Ｂ０３＋０．３ ｍｍｏｌＬ ＣＴＡＢ（ｐＨ ８．０）；工作电压：１５ｋＶ；进样时间：１０ｓ；进样高度：２０ｃｍ；１－ＶＢｌ２；２－ＶＢ１；３－ＶＣ；４－ＶＢ６测得的模拟样品的维生素混合标准溶液和复方维生素Ｂ片样液的电泳图。
２．６ 线性实验及重现性
在上述优化条件下，将混合标准溶液连续进样５次，ＶＢｌ，ＶＢｌ２，ＶＢ６和ＶＣ峰高的相对标准偏差ＲＳＤ分别为２．２％，１．６％，３．９％，２．８％。迁移时间的ＲＳＤ分别为０．６５％，０．４３％，１．３％，０．７８％。为提高总体分析速度，采用外标法定量。配制一系列不同浓度的维生素ＶＢ１，ＶＢｌ２，ＶＢ６和ＶＣ的混合标准溶液，在选定的实验条件下测定峰高。维生素ＶＢｌ，ＶＢｌ２，ＶＢ６和ＶＣ的峰高（ｙ）和质量浓度ｘ（μ．ｇｍＬ）分别在５．５∽１．０ ｍｇｍＬ，１５～１．５ｍｇｍＬ，１．０∽０．４０ｍｇｍＬ，６．６～０．８０ｍｇｍＬ范围内呈良好的线性关系。检测限（ＳＮ＝３）分别为１．８，４．０，０．５０，２．９μｇｍＬ。线性回归方程分别为ｙ＝５．８３ｘ＋１０．２４（ｙ＝０．９８８）；ｙ＝８．４４ｘ＋１７．５６（ｙ＝０．９９０）；ｙ＝３．２８ｘ＋１２．３６（ｙ＝０．９８３）；ｙ＝６．２０ｘ＋２２．７１（ｙ＝０．９９４）。
２．７ 样品分析
将复方维生素Ｂ片用研钵研成粉末，准确称取相当于１片片剂质量的粉末，用运行缓冲溶液溶解，定容于５０ｍＬ容量瓶中，在选定的实验条件下，直接进样。样品分离电泳图见图１０加入一定量ＶＢ１，ＶＢ６，ＶＢｌ２和ＶＣ标准样品，进行加标回收实验，５次测定结果的平均回收率，相对标准偏差见表１。 |
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